Nový chemoenzymatický způsob přípravy nitrilů z karboxylových kyselin
Biokatalýza se stala důležitou součástí organické syntézy, ale dosud postrádá některé z žádaných metod, jako je např. konverze karboxylových kyselin na nitrily. Proto navrhujeme šetrnou a ekologickou chemoenzymatickou kaskádu, která bude kombinovat dva enzymy, karboxylát reduktasu (CAR) a aldoximdehydratasu (AOxD) s chemickou konverzí produktů CAR (aldehydů) na substráty AOxD (aldoximy). Cílový proces (přeměna kyseliny na nitril) je tedy formálně reverzí reakce katalyzované nitrilasou (této obrácené reakce nebylo však s nitrilasou nikdy dosaženo). Pro tento účel budou kmeny E. coli vybaveny geny pro i) CAR a její pomocný protein, a ii) pro AOxD, přičemž budou vybrány stabilní CAR a AOxD s širokou substrátovou specifitou. Optimálním řešením bude koexprese těchto genů a transformace kyselin na nitrily in vivo. Ekologický význam nového postupu spočívá zejména v tom, že se v něm nepoužívá kyanid a je možné využít karboxylové kyseliny z obnovitelných zdrojů jako ligninu.
Stresové odpovědi bakteriálního degradéra toxických polutantů Rhodococcus erythropolis
Objektem studia je účinný degradér toxických aromatických polutantů Rhodococcus erythropolis CCM2595, u něhož byla určena úplná sekvence genomu. Hlavním cílem je objasnit mechanismy stresové odpovědi v buňkách rostoucích na fenolu jako modelovém toxickém polutantu. Bude studována exprese genů účastnících se stresové odpovědi na fenol, jak na genomové úrovni sekvenováním RNA, tak na úrovni jednotlivých genů pomocí technik in vivo a in vitro. Bude analyzována úloha alternativních sigma faktorů RNA polymerasy při stresové odpovědi. Budou definovány promotory stresových genů a budou objasněny jejich regulační souvislosti se stresovou odpovědí a funkcí sigma faktorů. Bude navržena komplexní regulační síť sigma faktorů a příslušných stresových regulonů. Exprese vybraných genů kódujících stresové proteiny, u nichž byla prokázána účast při odpovědi na fenolový stres, budou modifikovány s cílem vyvinout kmeny R. erythropolis se zvýšenou rezistencí ke stresovým faktorům a účinně degradujících toxické látky.
Konstrukce modelu regulační sítě řízené sigma faktory RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Bakteriální holoenzym RNA polymerasa se skládá z jádra enzymu a disociovatelné sigma podjednotky, která je zodpovědná za rozpoznání specifických sekvencí promotorů. Genom bakterie Corynebacterium glutamicum kóduje primární sigma faktor SigA a 6 alternativních sigma faktorů, které se účastní zejména transkripce genů stresové odpovědi. Projekt je zaměřen na objasnění rolí sigma faktorů v expresi genů C. glutamicum a na navržení struktury a zkoumání funkcí regulační sítě řízené sigma faktory. K analýze regulonů řízených specifickými sigma faktory (sigmulonů) budou použity metody jak na úrovni genomu, tak detailní analýzy jednotlivých genů a jejich promotorů. Pro dosažení komplexních výsledků budou kombinovány metody in vivo, in vitro a in silico. Hlavními úkoly projektu bude definovat oddělené i překrývající se regulony řízené sigma faktory, přiřadit sigma faktory jednotlivým promotorům a stanovit konsensus sekvence různých typů promotorů. Všechny získané poznatky budou integrovány v návrhu modelu regulační sítě C. glutamicum řízené sigma faktory RNA polymerasy.